• A. Metode directe
• B. Metode indirecte

In general, un diagnostic de laborator intereseaza atat individul cat si colectivitatea, urmarind astfel :

–           stabilirea etiologiei microbiene la bolnav aflat in diferite statii ale bolii, prognosticul si eficienta tratamentului administrat ;

–           stabilirea sursei si caii de transmitere a agentului patogen implicat ;

–           stabilirea starii de purtator cu agenti microbieni patogeni sau conditionat patogeni ;

–           identificarea formelor inaparente/latente de boala ;

–           evaluarea statusului imunitar.

Diagnosticul de laborator in patologia microbiana cuprinde doua moduri de investigatie:

A. METODE DIRECTE

1. Diagnostic bacteriologic (direct):– detectarea agentului patogen, a componentelor lui sau a unui produs (ex. toxina) în prelevate de la bolnav sau din mediul extern.

Etape:

a.Prelevarea si transportul probelor de laborator.

Pentru a obtine un rezultat corect se impune respectarea următoarelor reguli preanalitice:

-recoltarea sa aiba loc cat mai aproape de debutul bolii;

-prelevarea probelor se face înainte instituirii tratamentului antimicrobian;

-se folosesc recipiente sterilizate pentru a preveni contaminarea produselor (se indică utilizarea recipientelor tipizate, ex: urocultor, tampon recoltare, eprubete);

-recoltarea să fie corect efectuată de catre pacient sau personalul medical, pentru a preîntâmpina contaminarea în timpul recoltării;

-produsul să fie corect etichetat si transportat la laborator în condiţii corespunzătoare.

Exemplu:

Secretia vaginala

• in cervicite – recoltare scurgere muco-purulenta: se indeparteaza mucusul de la nivelul cervixului – comprese sterile, cu tampoanele(3) se recolteaza produsul patologic prin introducerea si rotirea in canalul cervical; Tampon 1- frotiu Gram, Tampon 2 -cultivare N.gonorrhoeae, Tampon 3 –frotiu Giemsa- C.trachomatis.

in vaginite – recoltare secretie; din fundul de sac vaginal, cu tampoane(3) sterile care apoi se introduc in mediu de transport ( nu se pastreaza la frigider: N. gonnorhoeae moare ); Tampon 1- in 0,5 ml solutie salina isotona 370C apoi examinare lama/lamela, Tampon 2 – frotiu Gram, Tampon 3 – Cultivare pentru Candida- iar la solicitare cultura pentru: N.gonorrhoeae, S.aureus, Streptococcus pyogenes, etc.

1. Examenul macro- si microscopic (preparat proaspat, frotiu din prelevat fixat si colorat) – metodă pentru orientarea diagnosticului – aduce informatii despre prezenţa bacteriilor, numărul, morfologia şi structura bacteriilor, precum şi despre caracterele lor tinctoriale (capacitatea bacteriilor de a fixa diferiţi coloranţi).

Exemplu :

• preparat proaspat intre lama si lamela:

– in sediment urinar: se urmareste prezenta leucocitelor, hematiilor, celulelor epiteliale, cristalelor, florei bacteriene, levurilor, cilindrilor, etc.

• Frotiu direct din produs:

– coloratia Gram: evidentiaza prezenta microorganismelor, morfologia (forma, marime, dispozitie caracteristica), tinctorialitatea (Gram+ sau Gram -), relatia cu PMN (diplococi intra si extra leucocitari) ;

– coloratia Giemsa : permite vizualizarea cu acuratete a morfologiei celulare, aprecierea cantitativa a predominantei PMN/ aprecierea reactiei inflamatorii, prezenta anomaliilor/ atipiilor celulare/ suspiciune de modificare neoplazica,

c.Evidenţierea antigenelor bacteriene solubile în lichide biologice (ser sangvin, urină..) prin metode serologice

d.Detectarea ADN-ului microbian (reacţii de hibridizare, amplificare genică – PCR)

2. Izolarea germenului în cultură pură:
3. Însămânţarea şi cultivarea pe medii de cultură

Insamantarea produselor patologice se face in mod steril, cu ansa bacteriologica, tamponul de exudat sau pipeta Pasteur, folosind medii de cultura sterile si de compozitie adecvata (care sa asigure conditii optime de dezvoltare microbiana, de crestere si multiplicare), pe suprafata sau in profunzime, cu scopul obtinerii de culturi microbiene pure si colonii izolate.

1. Inoculare la animale de laborator – Metoda de izolare a bacteriilor in vivo (exemplu: pneumococul sau Klebsiella la soarece)
2. Identificarea germenului izolat din cultură pură:
3. cercetarea caracterelor de cultură şi morfotinctoriale

–  morfologice (frotiu Gram/ AM(albastru de metilen)/ din colonie),

– caractere de cultura: S/ smooth (cremoase), R/ rought (rugoase), M (mucoase, capsulate), hemoliza, pigment, invazie etc

1. cercetarea caracterelor biochimice şi de metabolism – diferentiaza pe baza proprietatilor enzimatice (vizualizate pe un substrat colorat, prin modificatre de pH, virare de culoare) specii bactreriene, in cadrul genului, familiei etc.
2. determinarea structurii antigenice prin:

reacţii de aglutinare

reacţii de precipitare

reacţii de umflare a capsulei

1. determinarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia)
2. tehnici de detectare a ADN microbian – metode de biologie moleculara/ tehnici PCR
3. Determinarea patogenităţii germenului izolat prin:
4. teste in vitro – identificarea factorilor de patogenitate (Ex: coagulaza libera la Staphylococcus aureus) ; evidentierea efectelor patogenitatii bacteriene pe culturi celulare ;
5. teste in vivo – infectia experimentala la animalul de laborator

5. Determinarea sensibilităţii/rezistentei germenului la antibiotice şi chimioterapice – antibiograma

B. METODE INDIRECTE

1.Serodiagnosticul – depistarea şi titrarea anticorpilor specifici  în serul bolnavului. Anticorpii se urmăresc în dinamică – apar peste 7-10 zile de la debut si persistă deseori după vindecare.

2.Intradermoreacţiile (reacţii biologice cutanate de diagnostic) – apariţia unei reacţii celulare locale (eritem, infiltrat) la 2- 4 zile de la introducerea pe cale epidermică sau intradermică a alergenului microbian.